新冠肆虐已经是第三个年头，关于新冠的致病机制的研究，疫苗的研发，治疗方案的调整，以及后遗症的表现，全世界的科学家都在马不停蹄的探索。而好的技术，就是能助力我们更加高效精准的拿到结果，加速我们研究的脚步。近两年来，我们看到很多新冠研究文章的发表，而很多文章中用到了10x Genomics的单细胞测序技术，Cytek的全光谱流式细胞分析技术，以及在病理切片上进行探索的多色免疫荧光技术。
文章摘要
2019年新型冠状病毒(COVID-19) 的免疫反应动态及其严重表现已在循环领域中进行了广泛研究。在这里，研究人员通过相对于健康对照的重度COVID-19患者气道和血液样本的纵向表型、转录组学和细胞因子谱，研究人员揭示了呼吸道免疫过程与血液循环之间的关系。在COVID-19气道中，T细胞表现出活化的、组织驻留的以及保护性的特征。较高的T细胞频率与生存率和年龄相关。COVID-19气道中的髓样细胞具有高炎症特征，这些细胞的更高频率与死亡率和高龄有关。在COVID-19血液中，异常的CD163+单核细胞比常规单核细胞占优势，并且在相应的气道样本和受损的肺泡中被发现。气道中高水平的骨髓趋化因子表明这些细胞通过CCL2-CCR2趋化因子信号轴募集。这些研究为推动COVID-19肺部病理的免疫过程研究提供了全新见解，并对气管炎症靶向治疗具有指导意义。
图：气道和全身免疫反应的纵向分析揭示髓样细胞驱动COVID-19严重肺部炎症
研究结果
1.通过Cytek全光谱流式分析COVID-19重症患者气道和血液中不同的免疫细胞组成
本研究使用Cytek全光谱流式细胞术35色高维检测方案分析了来自COVID-19重症患者的141例血液和气道细胞样本，患者年龄14-84岁。并与健康对照组气道样本(n=5)和血液样本(n=5) 进行了比较。检测发现COVID-19阳性患者的气道细胞样本表现出与对照组相似的免疫细胞组成，其主要的免疫细胞是髓系细胞，T细胞频率较低，B细胞和ILCs可忽略不计。相比之下，血液中COVID-19阳性组与对照组之间的免疫细胞组成存在多种差异，包括CD4+和CD8+T细胞频率下降，髓系细胞频率大幅增加。对COVID-19患者选用不同时间采样，发现气道和血液中独特的免疫细胞组成随时间的变化是稳定的。这些发现表明，血液中的免疫主群分布的变化会比气道更为显著。进一步研究表明，气道免疫细胞亚群的年龄相关性改变与重症COVID-19的生存有关，血液中不呈现相关性。气道髓样细胞与年龄呈较强的正相关，总细胞数和CD4+ T细胞比例与年龄呈负相关。通过全方面的免疫细胞评估，研究人员发现气管中T细胞和骨髓细胞的比例与年龄和预后相关，提示这些细胞群在COVID-19疾病发病机制中发挥特定作用。
图：COVID-19患者气道和血液中的免疫细胞组成与健康对照组的比较
2.10x Genomics单细胞转录组分析揭示了气道免疫细胞中活化和炎症特征的偏好性表达
为了剖析重症COVID-19中T细胞和骨髓细胞的功能状态，本研究通过10x Genomics scRNA-seq对来自4名患者的每日配对气道和血液样本（总共 126,564 个细胞）进行单细胞转录组分析。得到了与Cytek全光谱流式细胞术一致的免疫细胞组成，以及其他气道细胞类型，如上皮细胞和离子细胞。对气道和血液之间的T细胞和髓系细胞的转录组谱进行协调分析，揭示了呼吸道中的免疫过程是如何与循环中的免疫过程相连的。在COVID-19气道中，T细胞表现出活化的、组织驻留的以及保护性的特征。较高的T细胞频率与生存率和年龄相关。
图：T细胞和骨髓细胞的炎症基因特征在COVID-19患者的气道中富集
3.重症COVID-19 患者气道中的炎症因子高度升高
为了研究炎症标志物的转录表达是否与分泌蛋白相关，本研究使用微流控多路分泌组蛋白质组学平台测量了每个COVID-19患者气道上清液和血浆样本中的细胞因子和趋化因子水平，这些结果显示，在气道中产生了促炎趋化因子和细胞因子，而仅在血液中检测到其中的一部分。
图：COVID-19 气道含有高度升高的骨髓和 T 细胞衍生细胞因子
4.通过多色免疫荧光技术研究COVID-19重症患者肺部单核细胞和巨噬细胞的积累
研究假设，气道中单核细胞趋化因子的产生可能会招募调节失调的血液单核细胞到肺中。因此，本研究检测了COVID-19弥漫性肺泡损伤患者的肺尸检样本中的T细胞和髓系细胞，本研究采用七色免疫荧光试剂进行染色，研究发现，与未感染肺相比，COVID-19中CD163+ 单核细胞和巨噬细胞的频率和密度显着增加，而淋巴细胞（CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞）和中性粒细胞的数量和密度和对照肺之间相似。然而，COVID-19气道和血液中的骨髓细胞不表达与增殖相关的基因（Ki67、TOP2A、UBE2C）。这些发现，连同本研究对气道和血液中骨髓细胞的表型、转录组学和功能分析，强烈暗示骨髓细胞募集是导致COVID-19重症患者炎症和发病机制持续存在的主要机制。
图：与对照肺相比，COVID-19 肺尸检显示出单核细胞和巨噬细胞的特异性和广泛积累
